石蜡切片的制作步骤（附图）

石蜡切片的制作步骤（附图）

植物组织石蜡切片技术农学类学生需要掌握的一门基本实验操作技术。

1.取材

确定所取材料的来源及部位，纵切还是横切；

取材要迅速，防止阻止发生进一步变化，材料体积要适宜。

下图为植物芽体取样实拍。

2.固定

（1） 固定液的选择

最常用的固定液为FAA（万用固定液）。

它的优点是材料固定时间不受限制，固定时间短则数小时，长则数月或数年。（可做材料保存液）

配方： 50％或70％酒精 90ml

冰醋酸 5 ml

福尔马林 5 ml

(柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制)

（2）材料固定后的处理

冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。

(材料固定后，若暂时不能进行下一步操作，可于70%的酒精溶液或直接与FAA固定液中，于冰箱中4℃存放。)

下图为固定液浸泡的组织切块。

3.脱水

目的：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。

试剂：梯度酒精溶液

流程：70%---85%---95%--100%---100% 每步1h-2h左右。

注意事项：保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但也不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩，这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下，不必完全按照本操作来）。

下图为自动组织脱水机，适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。

4.透明

目的：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。

(二甲苯是最常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶)

流程：二甲苯与酒精的等体积混合液1h---纯二甲苯1h---纯二甲苯1h。

5.浸蜡与包埋

目的：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。

浸蜡程序:(恒温)

（1）低温浸蜡（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和（石蜡不能溶解），过夜12-24h。

（2）高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃ ）：

将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24h。纯石蜡需要更换三次。

关于石蜡的选择石蜡熔点：

对于较硬的材料，用熔点较高的石蜡进行包埋；

当切片较薄时（在8μm以下），选用熔点较高的石蜡包埋；

夏季宜采用熔点较高的石蜡（56,58℃）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52,54℃）。

6.切片

传统的切片方法是将包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上，上机切片。

新型的切片方法是将包埋框（见下图）代替木块的支撑作用，上机切片。

切片的厚度可以根据自己的实验要求来确定，一般在8μm-20μm范围内。

（下图为传统切片机与新型自动切片机）

7.粘片与烤片

粘片：用粘片剂将蜡片牢附于载玻片上，防止在后续的操作中材料脱落。

在载玻片上涂抹粘片剂（甲液），再滴蒸馏水（乙液），放上蜡片，用滤纸吸取多余的水分。

烤片：将载玻片放于40℃展片台中烤干。

常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 配方：

甲液：明胶 1g 乙液：甲醛 4 ml

蒸馏水 100ml 蒸馏水 100ml

甘油 15 ml

苯酚 2g

8.脱蜡与复水、染色

脱蜡目的：干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。

复水目的：脱蜡后的材料，如果不经过复水，直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。

染色目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。

总体流程：二甲苯→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→番红（4h以上）→95％酒精→固绿（迅速）→95％酒精（迅速）→100%酒精→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→二甲苯→二甲苯，以上各级约需5～10分钟，已注明时间的除外。

染色剂：1%番红（85%酒精配制）

0.5%固绿（95%酒精配制）

9.切片脱水、透明和封固

接上步，在载玻片上滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。

切片放入42℃温箱中干燥过夜。镜检，将合格的切片贴上标签。

封固剂选择加拿大树胶（Canada balsam）或中性树胶

至此，植物组织的石蜡切片大功告成！

（下图为加拿大树胶）