血凝试验的操作步骤及方法

血凝试验的操作步骤及方法

血凝实验是血清学中最常见的凝集实验，可以检测多种特异性抗体，比如鸡的新城疫，禽流感等等

实验原理：

血凝试验（HA)实验原理

一些病毒表面有血凝素，能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝集，叫做血凝试验。

病毒的悬液中加入特异性抗体，红细胞的凝集现象被抑制，称为红细胞的血凝抑制。

目的：

¢用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴定该特异性抗体的水平。

ü4单位抗原的制备：

根据血凝试验测定的标准抗原的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数。

方法举例为：如病毒HA效价为8log2，其4个血凝单位为6log2，则病毒稀释64倍即可。

根据样品数确定所需抗原量做稀释

.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与血液比例为1:4）

2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以2000~3000r/min，5~10min离心3-5次。

3.弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。

取96孔微型血凝反应板，用微量移液器吸取pbs25ul，从第一孔加到第十二孔，每孔25ul。

吸取25ul新城疫标准抗原加入第一孔，进行吹打3—5次，充分混匀后，从第一孔吸出25ul，加入第二空再次吹打3—5次，充分混匀后在从第二孔吸出25ul加入第三孔混匀，以此类推，一直倍比稀释至第十一孔。

吸取25ulpbs从第十二孔倒加至第一孔且要悬加。

吸取25ul1%鸡红细胞悬液从第十二孔倒加至第一孔且要悬加。

之后放在微量移液器上震荡混匀。在室温（20摄氏度—25摄氏度）下静置40min。读数得到结果

取96孔微型血凝反应板、用微量移液器吸取pbs 25ul，从第一孔加至第十一孔，第十二孔加入50ul.接着吸取待检血清25ul加入第一孔吹打3-5次，混合后从第一孔中吸出25ul加入第二孔，吹打3-5次，混匀后再从第二空中吸出25ul吹打3-5次，以此类推倍比稀释到第十一孔。

实验人员作好记录，清理台面，医疗垃圾分开处理，进行消毒。